培养条件：使用DMEM培养基，添加10% FBS和1% P/S，适宜于贴壁细胞的培养。培养温度保持在37℃。在首次传代时，建议使用1:2的分瓶比例。每两天换液一次，建议同时购买细胞和培养基，整体购买享有优惠。收到细胞后，处理并培养至良好状态，然后装满完全培养液并妥善封口，这样可以确保细胞运输的安全。

收到细胞后，首先用75%酒精对整个细胞瓶进行消毒，随后在超净台内进行严格的无菌操作。将细胞瓶放置于37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时，以便细胞适应环境，之后再进行下一步处理。使用显微镜观察细胞的生长情况，并拍照留存（建议拍摄40x、100x和200x下的图像各一张）。前三天的细胞照片是重要参考依据，若不提供照片则默认收到细胞状态良好。

细胞培养步骤：

a. 细胞传代：若细胞汇合度未超过80%，将瓶内培养液收集至离心管，保留5ml完全培养基并放置于37℃、5% CO2的培养箱中。若细胞密度超过80%，可立即进行传代。细胞传代的具体步骤为：

• 弃去培养上清，用不含钙、镁的PBS对细胞进行1-2次洗涤。
• 加入约1-2ml的0.25%胰蛋白酶消化液至培养瓶中，放入37℃培养箱中消化1-2分钟，观察细胞状态，若细胞大部分已变圆并脱落，迅速取回，轻敲培养瓶并加入5ml以上的完全培养基终止消化。
• 轻轻吹打细胞，确保其完全脱落后吸出，再将悬液转移至15ml离心管中，在1000RPM下离心5分钟，弃去上清，添加1-2ml完全培养基重悬。
• 将细胞悬液按1:2的比例分装到两个T25培养瓶中，补充新完全培养基至5-8ml/瓶，最后置于37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。

b. 悬浮细胞传代：

• 采用半换液法时，将培养瓶竖立静置1小时，轻轻吸去约3ml的培养基，再补充3ml的完全培养基。如果培养基变色较慢，可以直接加入约500ul FBS。在传代时直接补给5ml培养基分装至两个培养瓶，一般此法可进行3次传代后，再进行离心去除死细胞。
• 若需分瓶，可收集细胞悬液于离心管中，在1000RPM下离心5分钟，弃去上清，加1-2ml培养液后重悬，将细胞悬液按1:2的比例分入新T25瓶中，添加6-8ml新完全培养基，确保细胞生长活力，后续根据实际情况进行1:2~1:5的传代。

c. 细胞冻存：

• 当细胞生长至覆盖培养瓶80%时，弃去培养液并用PBS清洗细胞一次。
• 加入约1ml的0.25%胰蛋白酶消化液，观察细胞变化，待细胞变圆后加入5ml完全培养液终止消化，轻轻吹打使细胞脱落，转移悬液至15ml离心管中，1000RPM离心5分钟。
• 弃去上清，加入1ml雅吉生物无血清冻存液（货号：C7001），混匀后转入冻存管中。
• 将细胞冻存管直接放入-80℃冰箱，如后续需转入液氮罐，需先在-80℃冰箱中存放24小时以上。

d. 细胞复苏：

• 从液氮中取出冻存管（务必佩戴好防护装备），快速放入37℃水浴中解冻，直至无冰晶后，用75%酒精擦拭管外壁。
• 将冻存管内细胞转移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000RPM离心5分钟。
• 弃去上清，用5ml完全培养基重悬，接种至T25培养瓶，放于37℃、5% CO2培养箱中。
• 第二天更换新鲜完全培养基继续培养。

注意事项：某些细胞在运输过程中可能会脱落，属于正常现象。若脱落较多，可将培养瓶内液体收集于离心管中，以1000RPM离心5分钟，收集上清进行过渡培养，沉淀后加入1-2ml胰酶，轻轻吹打后消化1-2分钟，添加5ml完全培养基终止反应，再离心、弃去上清，重悬于1-2ml完全培养基中，最后按1:2比例分装至两个T25瓶，补充新培养基至5-8ml/瓶，放入37℃、5% CO2培养箱中继续培养。

使用尊龙凯时的培养方案，能够有效提高细胞的生长与存活率，确保实验的顺利进行与结果的可靠性。