一、实验目的

1. 学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的基本原理；

2. 掌握紫外分光光度法在蛋白质含量测定中的实验操作技术；

3. 熟悉UV-1700PC紫外-可见分光光度计的使用方法，并了解其主要构造。

二、实验原理

紫外-可见吸收光谱法，又称紫外-可见分光光度法，是一种分析方法，依据分子在190nm至750nm波长范围内对光的选择性吸收进行研究。其吸收光谱源于分子外层价电子的跃迁，形成分子光谱并表现为带光谱。

在定性分析中，通常采用光谱比较法，将未知纯化合物的吸收谱特征与已知纯化合物的谱进行比较。定量分析依据朗伯-比尔定律：A=lgI0/I=εbc。当入射光波长和光程固定时，吸光度与物质浓度成正比。因此，通过测量特定波长下的吸光度，可以推算出溶液中物质的浓度。一般在最大吸收波长λmax处测量吸光度，以获得最佳灵敏度。

光度分析时，分别将空白溶液和待测溶液放入厚度为b的两个吸收池中，用一定波长的平行单色光照射，通过空白溶液的透光强度为I0，待测溶液的透光强度为I，根据公式得出吸光度。紫外-可见分光光度计由光源、单色器、吸收池、检测器和信号显示器等主要部件构成。光源的发光经过单色器分光，生成所需波长的单色光，经过样品池后照射到检测器上，生成光电流，并在信号显示器上直接读出吸光度A。

在生物医药领域，利用紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理包括：

1. 蛋白质在紫外光的可测量性：酪氨酸和色氨酸的苯环具有共轭双键，这使得蛋白质在275-280nm处表现出明显的吸收峰。根据朗伯-比尔定律，在一定浓度范围内，蛋白质溶液在最大吸收波长处的吸光度与其浓度成正比，适合进行定量分析，浓度范围一般为0.1-10mg/mL。

2. 准确度的限制：由于不同蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量及其微环境的差异，280nm处的吸光度会有所不同。根据统计，10mg/mL浓度的1800种蛋白质在280nm的吸收值范围在0.3-3.0之间，平均值为1.25±0.51，因此会影响测量的准确度。

3. 核酸类物质的干扰：若样品中含有嘌呤、嘧啶等核酸，280nm处的测量会受到干扰。由于核酸在260nm处的吸收强度较尖锐，必须利用280nm与260nm的差值来计算蛋白质含量。计算公式为：蛋白质浓度（mg/mL）= 145A280 - 0.74A260（A280和A260分别为280nm和260nm时的吸光度值）。

4. 稀溶液中蛋白质浓度的测定：蛋白质的肽键在200-250nm有显著的紫外吸收，其吸收强度与浓度成正比。在215nm处测量时，可减少干扰和光散射，采用215nm与225nm的光吸收差法进行蛋白质浓度测定，常用公式为：蛋白质浓度（mg/mL）= 0.144(A215 - A225)。

三、仪器与试剂

本实验使用UV-1700PC紫外-可见分光光度计，配备5个10ml的比色管和吸量管。试剂包括300mg/mL的标准蛋白质溶液和0.9% NaCl溶液，以及待测蛋白质溶液。

四、实验步骤

1. 启动计算机，开机主机电源，初始化工作站仪器。

2. 在工作界面选择测量项目（如光谱扫描或光度测量），本实验选择光度测量，并设置测量条件（如测量波长）。

3. 将空白溶液放入测量池中，点击“开始”进行空白扫描，然后进行零点校准。

4. 制作标准曲线。

五、数据处理

1. 将波长作为横坐标，吸光度作为纵坐标，绘制吸收曲线，并找出最大吸收波长λmax=278nm。

2. 以标准蛋白质溶液浓度作为横坐标，吸光度作为纵坐标绘制标准曲线，计算平均浓度、标准偏差等数据。常见结果为平均浓度=0.641088mg/mL，RSD为14.715%。在95%的置信区间下，蛋白质的含量可确定在允许误差范围内为0.641088mg/mL。

结合实验过程及结果，本实验利用尊龙凯时提供的先进设备和方法，展现了紫外分光光度法在生物医学领域中对蛋白质含量测定的关键应用，进一步推动了相关研究的进展。