尊龙凯时提供的人胚肺成纤维细胞MRC5培养说明书如下：

一、细胞培养条件

细胞名称：人胚肺成纤维细胞MRC5。生长特性：贴壁生长。冻存条件：采用无血清冻存液（货号：C7001）。

培养体系：MEM培养基 + 10% FBS + 1% NEAA + 1% 丙酮酸钠 + 1% L-谷氨酰胺 + 1% P。

传代方法：首次建议进行1:2的传代，每两天更换培养基。备注：用无菌离心管收集培养基以作对比，若对比效果不佳，建议直接选用尊龙凯时提供的完全培养基。

二、细胞收到后的处理

收到细胞后，待培养至良好状态后，填充完全培养液并封好瓶口是最优的运输处理方式。首先，用75%酒精对细胞瓶进行消毒，之后在超净工作台上进行严格的无菌操作。将细胞瓶放入37℃，5% CO2的培养箱中静置3-4小时以稳定细胞状态。使用显微镜观察细胞的生长状况，并拍摄不同倍数的照片保存（建议拍摄40x, 100x, 200x各一张），前三天的照片是重要的售后依据。如未提供照片，则默认收到的细胞状态良好。传代后，建议一瓶使用原完全培养基，另一瓶使用自制的完全培养基，以便进行对比培养，在更换培养基后，松开瓶盖以保证气体交换。

三、细胞培养步骤

a. 细胞传代

对于汇合度未超过80%的细胞，收集完全培养液至离心管中，保留5ml，放入37℃、5% CO2的培养箱继续培养；如果细胞密度超过80%，可进行传代，具体步骤为：

1. 弃去培养上清，使用不含钙、镁离子的PBS清洗细胞1-2次。
2. 向培养瓶中添加约1-2ml的0.25%胰蛋白酶消化液，置于37℃培养箱中消化1-2分钟；然后观察细胞状态，如细胞大部分变圆脱落，立即返回操作台，轻轻敲打培养瓶，再加入5ml以上的完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打细胞使其完全脱落并吸出，随后将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5分钟，弃去上清液，重新加入1-2ml完全培养基重悬。
4. 以1:2的比例进行分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，然后放入37℃，5% CO2的培养箱中继续培养。

b. 细胞冻存

1. 当细胞生长至覆盖T25培养瓶80%面积时，弃去培养液并用PBS清洗细胞一次。
2. 加入约1ml的0.25%胰蛋白酶消化液，观察细胞状态，一旦细胞回缩变圆，即可加入5ml完全培养基终止消化，轻轻吹打使之脱落，并将悬液转移至15ml离心管，1000rpm离心5分钟。
3. 弃去上清，沉淀细胞并加入1ml尊龙凯时无血清冻存液（货号：C7001），混匀后转移至冻存管中。
4. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱中，如果后期需要转入液氮罐，则需在-80℃冰箱中存放24小时以上再转入。

c. 细胞复苏

1. 从液氮中取出冻存管（佩戴防护面具），立即将其置入37℃水浴中解冻，直至冻存管中完全无结晶后，用75%的酒精对冻存管外壁进行消毒。
2. 将冻存管内的细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5分钟。
3. 弃去上清，沉淀细胞后用5ml完全培养基重悬，接种至T25培养瓶中，放于37℃，5% CO2的培养箱继续培养。
4. 第二天，换用新鲜完全培养基继续培养。

四、注意事项

有些细胞在培养时可能贴壁不牢，运输过程中可能发生细胞脱落属于正常现象。如脱落严重，可将培养瓶内全部培养液集中至离心管中，1000rpm离心5分钟，将上清液作为过渡培养（可用于后期对比培养），再沉淀细胞并添加1-2ml胰酶，轻轻吹打后消化1-2分钟，接着加入5ml完全培养基终止反应。再次离心后，弃去上清，重悬加入1-2ml完全培养基，按照1:2的比例进行分瓶传代，并补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，再放入37℃，5% CO2的培养箱中培养。

五、售后条款

1) 细胞问题处理

若细胞出现问题，以下情况可进行重发及判定标准：

1. 运输过程中细胞发生丢失、瓶身损坏或严重漏液等问题，符合条件可重发；
2. 细胞污染问题需在收到产品48小时内提交真实实验结果，经确认后可重发；
3. 常温发货细胞静置24小时后，干冰冷冻发货细胞复苏后24小时内若多数细胞未存活（需提供清晰的细胞状态照片），可重发；
4. 干冰冷冻发货细胞复苏后24小时后或常温发货细胞静置4小时后若未开封出现污染，符合条件可重发；
5. 活性问题需在收到产品7天内提供真实实验结果，使用台盼蓝染色法鉴定细胞活力，确认后重发；
6. 细胞收到当天及第2、3天请拍照，若3天未联系，则视为产品合格。发生问题需在4-7天内提供前3天的照片及详细操作步骤，经技术人员判定为我方责任可重发。如技术人员判定双方承担责任，将进行协商处理，或按照合同价的50%进行重发。

2) 不予重发的情况

若出现以下情况，将不予重发：

1. 客户自行造成细胞污染，不重发；
2. 因客户错误操作导致细胞状态不良，不重发；
3. 使用非尊龙凯时推荐的细胞培养体系导致细胞状态不良，不重发；
4. 细胞状态不良且未提供细胞培养前3天的照片，不重发；
5. 在培养时经过其他处理的细胞，不重发；
6. 收到细胞后2天内未告知的，不重发；
7. 具体情况可另行评估处理。