当科研同事讨论他们珍贵的RNA样品时，我们常常听到“把那个试管放在冰上！”以及“希望它不会降解”的声音。这是因为RNA的稳定性一般不如在分子生物学研究中常用的其他大分子（例如DNA或蛋白质）更强。因此，在CRISPR/Cas9实验中使用的RNA（即“gRNA”）同样面临着“脆弱性”的挑战。

为了应对这一问题，研究表明gRNA可以通过化学修饰来增强其抗降解能力，同时依然能够有效引导Cas9产生靶向断裂。这些gRNA技术的进步不仅提升了靶向效能，还减轻了对RNA状态的担忧。一些gRNA修饰甚至不仅提高了稳定性，还增加了“颜色”及改变了“开关”的功能。

稳定gRNA修饰的磷酸糖骨架提供了大约20nt的引导序列，指导较大的CRISPR RNA（crRNA）。除了20nt的引导序列，crRNA的3'末端还含有大约20nt的重复区域，这一重复区域与Cas9蛋白的转激活RNA（tracrRNA）相互作用。这些RNA分子极容易受到细胞质和核酸酶的攻击，因为它们往往被识别为外源RNA。为了保护RNA免受降解，目前有多种简单的方法可以修饰RNA骨架的糖或磷酸分子，从而提升其稳定性。

自然界早已进化出一系列机制以防止重要的细胞RNA分子通过翻译后修饰而降解。最常见的防护方式是2'-O-甲基化，它在核糖的2'羟基上添加甲基，从而保护RNA免受核酸酶的攻击。另一种在同一位置上发现的修饰是2'-氟（2'-F），它用氟替代了2'位置的羟基。若在糖环中移动一步，3'-硫代磷酸酯键便成为一种流行的稳定修饰，其中的硫取代了非桥接磷酸氧。其他有所应用的骨架修饰还包括酰胺键、锁定核酸和约束的乙基。

那么，哪种RNA骨架修饰的表现更佳？研究表明，将几种修饰结合在一起，像是硫代磷酸酯与2'-O-甲基修饰的联用，能比单一修饰更具稳定性。这些修饰可以通过市售试剂盒在实验室内完成，或在购买gRNA时作为合成修饰进行订购。通常，这些修饰会掺入到crRNA分子的末端（通常是前3个核苷酸中的1-3个被修饰），以获得最佳的稳定性和有效性。

而在RNA之上，更加稳固的是脱氧核糖核酸（DNA）。一种提高gRNA效率的有效方式是将几种核糖核苷酸替换为脱氧核苷酸。含有部分DNA的gRNA对Cas9蛋白表现出意外的耐受性，且可提升靶向效率。同样，锁定核酸或桥接核酸也能被引入到gRNA当中。这些修饰会导致构象受限，从而提升错配识别能力，并增强抵抗核酸酶的能力，减少脱靶事件。尽管两者具有相似的优点，但N-甲基取代的桥接核酸在哺乳动物细胞中效率稍高且毒性较小。

在CRISPR/Cas9研究中，一些RNA稳定修饰的技术也是在siRNA和反义寡核苷酸等之前的研究中开发的。其中一些合成修饰，特别是那些在gRNA中不包含5'-三磷酸盐的修饰，能够显著降低与gRNA引入相关的先天免疫反应。这在由于引入外源RNA而导致活力受损或正在研究免疫反应的实验中特别重要。

在gRNA的修饰方面，最近的进展让我们可以利用可光激活和可光切割的gRNA来克服这些问题。通过向gRNA的20nt靶向区域引入单个可光切割的2-硝基苄基接头，产生了可在适当光线条件下裂解并变得无效的gRNA。在这种系统中，光激活的对应物使用被光笼禁止参与靶序列的gRNA，经过短暂的光照后，这些gRNA得以释放，CRISPR/Cas9系统能够启动靶向编辑事件。这两种技术均通过对RNA的化学修饰实现，并可通过简单的LED灯控制整个编辑系统。

在靶向实验中对gRNA进行染料标记能够直观地观察转染效率，甚至在细胞实验中进行定位追踪。有多种合适的染料可供选择，您可以选择自己动手使用试剂盒，或者购买带有标签的商业合成染料。如果您觉得选择不够，可以选择对crRNA或tracrRNA进行染料标记。当然，在单导向系统中（crRNA和tracrRNA作为单一分子），您可能不需要此方案，但始终有多个染料供您选择。

在CRISPR/Cas9这一实验模块中，相信您的学习已取得了显著进展。如果您在寻找与Cas蛋白相关的原材料，欢迎访问尊龙凯时，我们即将推出的CRISPR/Cas系列蛋白产品期待与您相遇！

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