在生物医疗研究中，当科研人员提到他们珍贵的RNA样品时，常常会听到“把那根试管放在冰上！”和“我希望它不会降解”。RNA本身在分子生物学研究中相比于许多其他大分子（如DNA或蛋白质）更加脆弱。因此，在CRISPR/Cas9实验中使用的RNA（即“gRNA”）同样面临着“易碎”的问题。

为了应对这一挑战，目前的研究表明，通过化学修饰，gRNA可以在保持其引导Cas9产生靶向断裂功能的同时，增强其抵抗降解的能力。这些gRNA的技术进步不仅提升了靶向效果，还减轻了关于RNA稳定性的不必要顾虑。一些gRNA修饰甚至增加了“颜色”或改变了“开关”机制。

稳定的gRNA修饰主要集中在磷酸糖骨架，对CRISPR/Cas9靶向识别序列的约20nt长的gRNA进行引导。除此之外，crRNA的3'末端还包含一个约20nt的重复区，这一重复区与Cas9蛋白的相互作用相关。由于这些RNA分子可能被细胞质和核酸酶识别为外源RNA，因此容易受到攻击。为了保护RNA免受降解，目前已经有数种简便的方法，能够通过修改RNA的糖或磷酸基团来提高其稳定性。

自然界已经通过进化产生了一些防止重要细胞RNA分子降解的方法。其中最常见的修饰方式是2'-O-甲基化，这种方式通过在核糖的2'羟基上添加甲基，来保护RNA免受降解。此外，在2'位置用氟替代羟基的2'-氟（2'-F）修饰也被发现有很好的稳定效果。而在糖环上，3'-硫代磷酸酯键的修饰则以硫取代了非桥接磷酸氧，这些都是在RNA骨架上常用而有效的修饰。

那么，哪种RNA骨架修饰表现最好呢？研究显示，将多种修饰组合使用，如硫代磷酸酯与2'-O-甲基修饰一起，能够显著提高gRNA的稳定性。这些修饰可以通过市售试剂盒在实验室完成，或者在购买gRNA时作为合成修饰进行订购。通常，在crRNA分子的末端进行修饰（通常是在前3nt的1-3个位置进行修改），能获得最佳的稳定性和有效性。

而如果问还有什么比RNA更稳定的分子，答案则是脱氧核糖核酸（DNA）。一种提高gRNA效率的经济方式是将一些核糖核苷酸更换为脱氧核苷酸。DNA在CRISPR/Cas9系统中的耐受性相当良好，能有效提升靶向效率。此外，锁定核酸或桥接核酸也可引入到gRNA中，这些修饰能够限制RNA的构象，增强错配识别能力，从而提高核酸酶的抗性并减少脱靶事件。虽然两者的优点相似，但N-甲基取代的桥接核酸在哺乳动物细胞中的效率略高且毒性较小。

在CRISPR/Cas9研究中，一些RNA的稳定修饰是在之前针对siRNA和反义寡核苷酸的应用中已经开发出来的。采用这些合成修饰，特别是那些不含5'-三磷酸盐的gRNA修饰，能够有效降低与gRNA引入相关的先天免疫反应，这在由于引入外源RNA而引起的损害活力或研究免疫反应的实验中更加重要。

在gRNA的修饰方面，当前的进展还包括通过可光激活和可光切割的gRNA技术来克服问题。通过在gRNA的20nt靶向序列中引入可光切割的结构，这样的gRNA在适当的光线下一旦暴露不到一分钟就会被裂解，从而失去作用。同时，光激活的gRNA通过光笼处理，短暂光照后释放出功能部分，CRISPR/Cas9系统能够启动相应的编辑事件。

在靶向实验中，使用荧光染料标记gRNA可以使转染效率具象化，甚至在细胞实验中进行定位追踪。市面上提供多种合适的染料供选择，研究人员可以选择自行组合或为商业合成产品添加标签。在单个向导系统中，可能不需要对crRNA或tracrRNA进行标记，但可选择不同的染料以满足实验需求。

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